Laboratorní diagnostika pertuse

H. Bílková Fránková
Laboratoř Klinické mikrobiologie Ostrava, Laboratoře AGEL, a. s.
Ústav epidemiologie a ochrany veřejného zdraví, LF OU, Ostrava

„V roce 2016 bylo Světovou zdravotnickou organizací nahlášeno 139 535 případů pertuse; v ČR 627, pro srovnání v roce 2014 až 2 521 případů.“

Původcem onemocnění zvaného černý nebo také dávivý kašel je aerobní nepohyblivá gramnegativní bakterie Bordetella pertussis. Onemocnění vyvolaná příbuzným druhem Bordetella parapertussis probíhá většinou bez závažných klinických příznaků a komplikací, což je dáno absencí pertusového toxinu. U pacientů s respiračními infekty, endokarditidou, septikemií nebo např. otitidou byly izolovány také další druhy rodu Bordetella – B. bronchoseptica, B. holmesii, B. himzi, B. avium, B. trematum [1,2]. Vyvolaná onemocnění jsou zde většinou asociována s imunodeficitem.

Pertuse se velmi snadno šíří kapénkovou infekcí, je celosvětově rozšířena, výskyt onemocnění kolísá v 3–7letých cyklech i v relativně dobře proočkované populaci. Attack-rate je u domácích kontaktů uváděn až 90 %. V roce 2016 bylo Světovou zdravotnickou organizací (WHO) nahlášeno 139 535 případů pertuse; v ČR 627, pro srovnání v roce 2014 až 2 521 případů [3]. Skutečný počet onemocnění je však odhadován na více než 50 mil. osob, z nichž 300 000 na pertusi umírá [4].

Vnímavý jedinec je ten, který nemá ochranné protilátky po prodělaném onemocnění nebo po očkování. Ani postvakcinační ani postinfekční imunita není u pertuse trvalá. K vyvanutí imunity dochází již 6.–12. rokem po očkování, po prodělaném onemocnění je delší. Dospělý člověk prodělá mírnou formu pertuse průměrně 2,2× za život [5,6]. Nejnebezpečnější je onemocnění neimunních kojenců, u nichž může mít fatální průběh; transplacentárně přenesené protilátky do 2 měsíců věku vymizí.

Inkubační doba pertuse je obvykle 1–3 týdny. K vylučování bordetel dochází už na konci inkubační doby a trvá po celé období kašle, často i v rekonvalescenci. Nejvíce infekční je pacient v katarálním stadiu a v prvních 2 týdnech od začátku kašle. Neimunní kojenec může vylučovat bordetely i 6 týdnů [5].

Bakterie se po vstupu do vnímavého organizmu pomnožují a osídlují řasinkový epitel dýchacích cest, přičemž produkují řadu biologicky aktivních látek – pertusový toxin, filamentózní hemaglutinin, peractin, tracheální kolonizační faktor, faktor rezistence, dermonekrotický toxin, adenylátcyklasový toxin a tracheální cytotoxin. Pravým exotoxinem je pertusový toxin, který je nejvíce zodpovědný za systémové postižení [4].

Onemocnění má tři fáze. Během první, katarální, vzniká zánět epitelu sliznic laryngu a nosohltanu. V této fázi lze obtížně klinicky odlišit infekci od jiných respiračních infekcí. V paroxysmálním stadiu vzniká typický dráždivý kašel, způsobený zejména paralýzou mukociliárního transportu, do krevního oběhu pronikají toxiny bordetel. Paroxysmální fáze trvá obvykle měsíc. Následuje dlouhé období rekonvalescence, kde kašel může přetrvávat i měsíce. Včasnou diagnostiku komplikuje skutečnost, že se v proočkované populaci mění klinický obraz onemocnění, může probíhat mírně a atypicky.

V mikrobiologické laboratoři je možný přímý průkaz patogenu z nazofaryngeálního výtěru klasickými kultivačními metodami a průkazem přítomnosti DNA B. pertussis metodou real-time polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction – PCR). Rutinně máme zavedeny také sérologické metody – průkaz přítomnosti IgA, IgG a IgM protilátek proti pertusovému toxinu metodou ELISA a ImmunoBlotem. Přítomnost celkových protilátek prokazujeme aglutinací. Pro získání validního výsledku musí být odběr správně načasován, proveden a transportován do laboratoře.

Pro přímý průkaz kultivačními i molekulárně biologickými metodami odebíráme nazofaryngeální výtěr. Odběr se provádí na lačno, před umytím zubů, pacient by neměl před odběrem ani pít, žvýkat žvýkačku nebo kouřit. Pro kultivaci se provádí odběr do transportní odběrové soupravy AMIES s aktivním uhlím, pro PCR do transportního (universal transport medium – UTM) média – obojí dodá laboratoř. K odběru se používá tampon pro odběr z nazofaryngu, který se zasouvá přes nosní průduch podél nosní přepážky po spodní stěně nosní dutiny až k zadní stěně nazofaryngu a několikrát se tamponem otočí. Pro kultivaci je nutno uchovávat odebrané vzorky při pokojové teplotě; pro PCR reakci v lednici a co nejrychleji transportovat do laboratoře. Kultivace má vysokou specificitu, ale nízkou senzitivitu. Úspěšná je pouze u včasného odběru (do 2 týdnů od začátku kašle) a před zahájením antibiotické terapie. Na žádance musí být označeno, že jde o odběr na pertuse, kultivace probíhá na specifických půdách – v našem případě na nejčastěji používané – Bordet Gengou agaru. Negativní kultivace onemocnění nevylučuje. Za zlatý standard je v posledních letech považován spíše přímý průkaz DNA Bordetella pertusis. Důvodem je významné zvýšení senzitivity metody, detekce do 3–4 týdnů od začátku onemocnění, záchytu i přes antibiotickou terapii a dostupnosti metody, vč. cenové.

Nepřímá diagnostika pertuse je založena na průkazu specifických IgA, IgG a IgM protilátek v séru pacienta. V naší laboratoři provádíme rutinně průkaz celkových protilátek aglutinací, kde potvrzením infekce je buď sérokonverze, nebo 4násobný vzestup titru protilátek. Aglutinací prokazujeme zejména protilátky proti povrchovým strukturám bordetel; metoda má nižší senzitivitu i specificitu.

Metodou ELISA stanovujeme protilátky proti pertusovému toxinu. IgM protilátky jsou detekovatelné nejdříve – do 2 týdnů, mají krátký poločas a přetrvávají 2–3 měsíce. IgA protilátky se tvoří už po 1–2 týdnech, ale mohou perzistovat 6–24 měsíců. U kojenců je jejich tvorba zpomalena, objevují se až 6–7 týdnů po infekci. IgG protilátky bývají detekovatelné za 2–3 týdny a dlouhodobě přetrvávají. Maxima dosahují za 6–8 týdnů po infekci. Vzhledem k vysoké proočkovanosti populace acelulární vakcínou s obsahem pertusového toxinu je obtížné odlišit postvakcinační a postinfekční IgG protilátky. Hladina IgG a IgA protilátek je vyjádřena v mezinárodních jednotkách – IU/ml. Pro anti-IgG je stanovena hranice pozitivity na 100 IU/ml, pro IgA 20 IU/ml. IgM protilátky jsou vyjádřeny indexem pozitivity (IP), kde je hranice pozitivity 1,1 IP.

Metodou ImmunoBlot prokazujeme přítomnost specifických protilátek proti rekombinantním antigenům, které jsou navázány na nitrocelulózovou membránu. Výhodou je, že na membráně jsou antigeny jak pro B. pertussis (pertusový toxin, filamentózní hemaglutinin, adenylcyklasový toxin a tracheální kolonizační faktor), tak pro B. parapertussis (pertactin, fimbrie, entericidin A).

Pro sérologické reakce je nutno odebrat 3 ml srážlivé krve. Vhodné je odebrat první vzorek v akutním stadiu onemocnění, druhý v odstupu 2–3 týdnů. Výsledek sérologického vyšetření je nutné hodnotit současně s klinickým stavem pacienta. Obtížné je hodnocení výsledků u pacientů po očkování acelulární vakcínou, která obsahuje pertusový toxin, filamentózní hemaglutinin, peractin a fimbrie.

Literatura

1. Gross R, Keidel K, Schmitt K. Resemblance and divergence: the „new“ members of the genus Bordetella. Med Microbiol Immunol 2010; 199 (3): 155–163. doi: 10.1007/s00430-010-0148-z.
2. Tang YW, Hopkins MK, Kolbert CP et al. Bordetella holmesii-like organisms associated with septicemia, endokarditis and respirátory failure. Clin Infect Dis 1988; 26 (2): 389–392.
3. World Health Organization. Immunization, vaccines and biologicals. [online]. Available from: http: //www.who.int/immunization/diseases/ pertussis/en/.
4. Beneš J et al. Infekční lékařství. 1. vyd. Praha: Galén 2009.
5.  
6. Fabiánová K. Černý kašel na vzestupu. [online]. Dostupné z: http: //www.szu.cz/uploads/Epidemiologie/ 2014_Epidemiologie_pertuse_tiskova_konferenceSZU.pdf. Prezentováno na tiskové konferenci 20. 11. 2017, Praha.

Mgr. Hana Bílková Fránková, MBA
Laboratoř Klinické mikrobiologie Ostrava
Laboratoře AGEL, a. s.
Zálužanského 1192/15, 703 84 Ostrava