Covid-19 z pohledu infekční sérologie

B. Boualay
Centrum Očkování a cestovní medicíny Avenier, Praha 5

Souhrn

Informace a znalosti o historii, morfologii, vlastnostech a virulenci koronavirů obecně jsou klíčové pro jejich správnou detekci v bio logickém materiálu. V současnosti čelíme v medicíně složité situaci a laboratorní diagnostika SARS-CoV-2 (covid-19) je klíčová pro další diagnostický postup, terapii u pacientů a pro epidemiologii nákazy.

Klíčová slova

koronavirus – respirační infekce – SARS-CoV-2 – glykoprotein S – covid-19 – diagnostika RT-PCR – imunita

Úvod

První koronavirus byl izolován v roce 1937 [1]. Některá onemocnění u lidí způsobily kmeny koronaviru cirkulující mezi velbloudy, kočkami, netopýry, cibetkami i jinými zvířaty (uvádí American Society for Microbiology). První lidský koronavirus byl vykultivován v roce 1960 z nosní dutiny od člověka s infekční rýmou.
Virus covid-19 patří epidemiologicky do skupiny respiračních virů a taxonomicky podle typu a povahy nukleové kyseliny (DNA nebo RNA) ve virionu patří k obaleným jednořetězcovým RNA (ssRNA – single-stranded RNA), odpovídající mRNA o kladné polaritě. Dále patří k virům pozitivní polarity do genomu řádu Nidavirales, které mají helikální symetrii a zahrnují dvě čeledě – Coronaviridae a Arteriviridae.
Čeleď Coronaviridae tvoří dva rody, rod Coronavirus a rod Torovirus. Kromě lidských patogenů zahrnují tyto rody i veterinárně důležitá infekční agens.

Vlastnosti a struktura virionu

Koronaviry jsou středně velké, tzn. mají 100–150 nm, obalené RNA viry oválného tvaru se spirální symetrií. Viriony koronavirů jsou lemovány věncem řídce nasedajících kuželovitých výběžků, takže pod elektronovým mikroskopem mohou někomu připomínat květ s korunou okvětních plátků, někomu jinému zase slunce s koronou protuberancí (obr. 1). Tyto výběžky jsou tvořeny glykoproteinem S (z angl. spike – výběžek), který má mnoho důležitých funkcí:
• váže se na buněčné receptory;
• u některých koronavirů indukuje fúzi virového obalu s buněčnou membránou, příp. splývání infi kovaných buněk;
• vyvolává vznik neutralizačních protilátek i buněčné imunity.

U některých koronavirů jsou na povrchu obalu ještě další kratší výběžky – tvoří je glykoprotein HE. Tento glykoprotein se váže na acetylovanou kyselinu neuraminovou na buněčné membráně, a odpovídá tak za virovou hemaglutinaci a hemadsorpci a esterázovou aktivitou z ní odštěpuje acetylové skupiny. Další glykoprotein M protkává lipidovou dvojvrstvu obalu. Uvnitř virionu je uložena dlouhá spirála nukleokapsidy – obsahuje fosfoprotein N, jehož vazba s membránovými glykoproteiny M stabilizuje nukleokapsidu, která je pravděpodobně ohebná. Koronaviry dělíme do čtyř velkých skupin – alfa, beta, delta a gama. Pouze koronaviry alfa a beta způsobují infekce u lidí. Tyto viry se šíří vzduchem a jsou zodpovědné asi za 10–30 % chřipkovitých onemocnění celosvětově. Dosud bylo identifi kováno sedm lidských koronavirů:

• HCoV-229E;
• HCoV-OC43;
• HCoV-NL63;
• HCoV-HKU1;
• SARS-CoV;
• MERS-CoV;
• SARS-CoV-2 (covid-19).

I koronaviry, jako většina obalených virů, jsou citlivé k éteru a k tak slabým dezinfekčním látkám, jako jsou detergenty (detergent je směs tenzidů a dalších látek, která je schopna převádět nečistotu z pevného povrchu do kapaliny). Bylo pozorováno, že koronavirus 229E si při pokojové teplotě držel infekčnost v suspenzi nejméně 6 dní, po zaschnutí až 3 hodiny (obr. 2).

Prvním krokem v procesu množení koronavirů je vazba povrchového antigenu – glykoproteinu – na receptor hostitelské buňky. U lidských koronavirů je tímto receptorem enzym aminopeptidáza. Následujícím krokem je splynutí virového obalu s buněčnou membránou. Genomová RNA je přepsána do polyproteinu, ten je rozštěpen na funkční proteiny. Koronavirové části se syntetizují v cytoplazmě. Viriony poté dozrávají pučením do nitrobuněčných vakuol, ty posléze splývají s buněčnou membránou a viriony se uvolňují z buňky a zaplavují makroorganismus.
Přítomnost viru v našem organismu, ale zejména jeho struktura a vlastnosti, specifikují imunitní odpověď a možnosti její detekce diagnostickými soupravami v laboratorních podmínkách.
V laboratorních podmínkách in vitro lze některé kmeny koronavirů množit na lidských embryonálních buňkách (např. kmen 229E), jiné například až po adaptaci (kmen OC43). Mnohé koronaviry původně izolovali dr. David Tyrrell (virolog) a jeho kolega Paul Bynoe v Common Cold Research Unit v anglickém Salisbury v roce 1965 z některých případů infekční rýmy na orgánových kulturách lidské embryonální trachey a nosní sliznice. Orgánové kultury jsou v podstatě přežívající kousky řasinkového epitelu udržované v prostředí bez séra, tzn. že řasinkové buňky zůstávají diferencovány a kmitají. Jsou nejcitlivějším objektem k pěstování i ostatních respiračních virů. Koronaviry ale zpravidla pohyb řasinek neovlivní a v orgánové kultuře se musí prokazovat elektronovým mikroskopem [1,2,4].
Pro mnoho hospodářských a domácích zvířat jsou koronaviry patogenní, významný je například virus infekční bronchitidy drůbeže. U lidí přibližně jednu čtvrtinu onemocnění infekční rýmou vyvolávají lidské koronaviry. Napadají spíš dospělou populaci na rozdíl od rinovirů (více se infikuje dětská populace) a inkubační doba činí průměrně 3 dny. Aktuálně udávaná inkubační doba nového koronaviru covid-19 se odhaduje na 5–6 dní v rozmezí od 1 do 14 dní. Infekce ně kterými kmeny koronavirů se vyznačuje pouze příznaky postižení nosu (nosní sliznice), tzv. rinoreou – jedná se o kmeny, které jsou antigenně blízké kmenu 229E. Z klinických příznaků se u řady pacientů přidružuje škrábání v krku a kašel (kmeny blízké OC43). Zvlášť u dětí, ale i u dospělých mohou koronaviry vyvolat pneumonii. Při průjmech jsou zatím nálezy koronavirů ve stolici předmětem postupného přehodnocování a odborníci se domnívají, že většina těchto průjmovitých stavů bude nejspíš torovirového původu [1,3]. Připomeňme si situaci na přelomu roku 2002 a 2003, kdy se v jihovýchodní Číně objevily první případy syndromu akutního respiračního selhání SARS (severe acute respiratory syndrome). V sekretech nemocných byly prokázány koronavirové viriony a po objasnění jejich genomu se ukázalo, že původce SARS je zcela odlišný od dosud známých lidských koronavirů. Do lidské populace se pravděpodobně dostal od zvířat a jeho zdrojem jsou nejspíš některé z cibetek – šelmiček velikosti kočky, jejichž maso je v těchto zemích považováno za lahůdku. Tehdy byl ze zjevně zdravé cibetky Paguma larvata izolován koronavirus z 99 % totožný s původcem SARS. K infekci lidí došlo asi při chovu cibetek anebo při zpracování jejich masa, ne při konzumaci [1].
Infekce SARS se velmi snadno přenáší na ošetřující zdravotnický personál nejen kapénkami, ale i kontaminovanými předměty. Faktem je, že leteckou dopravou se onemocnění snadno šíří i do ostatních zemí. SARS se vyskytoval v Asii, především v Číně, v Hongkongu a na Tchai-wanu, z mimoasijských zemí byla postižena nejvíce Kanada, zejména Toronto.
Cílená terapie antivirotikem známa není, ale v současnosti se určité možnosti léčby nabízejí, např. experimentálním antivirotikem remdesivir (Gilead Sciences), a jako další možnost se jeví např. i Plaquenil s azithromycinem, ale vše je zatím ve fázi zkušební. WHO tenkrát vyzvala ke zrychlenému vývoji infekce [10]. V roce 2012 se objevila další infekce způsobená koronavirem MERS-CoV (Middle East respiratory syndrome coronavirus), který se šířil méně, ale byl virulentnější. Tyto dvě infekce se podařilo zastavit a výzkum se poté také zastavil, nejspíš proto, že přestal být komerčně zajímavý a experti se začali věnovat jiným problémům. Letos se ukázalo, že koronaviry bychom neměli podceňovat.
Imunita u covid-19 nebyla zatím objasněna. Studie na dobrovolnících s běžnými koronaviry způsobujícími nachlazení v minulosti poukázaly na to, že imunita vůči infekci týmž kmenem trvá nejméně rok, ale imunita vůči jinému, byť antigenně příbuznému kmeni během roku vymizí. Z toho vyplývá, že přirozené reinfekce koronaviry budou tedy zcela běžné [1–3]. K průkazu SARS byly tenkrát promptně vyvinuty diagnostické soupravy, které pomocí RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction – kvantitavní polymerázová řetězová reakce) dovedou detekovat sekvence RNA specifické pro přítomného původce infekce, přibližně od 10. dne onemocnění. Diagnózu lze stanovit i na základě nepřímého průkazu – nález protilátek metodou ELISA, protilátky se začínají tvořit pravděpodobně do 14 dní od začátku onemocnění [5].

Možnosti laboratorní diagnostiky

V současnosti je v laboratorní diagnostice prioritní detekce RNA a už v lednu 2020 byla zveřejněna sekvence nového koronaviru, a vědci jej tak postupně dokázali rekonstruovat. To by mohlo zpřesnit a urychlit diagnózu nemoci. Vědci mohou jednotlivé cílené mutace vnášet do genomu viru a podle nich bude možné zjišťovat, jak virové proteiny fungují a které jsou zodpovědné za to, že je tak virulentní [10]. Dále se vědci domnívají, že pokud vznikne vakcína, dalo by se lépe testovat, jak je pravděpodobné, že jí virus bude schopen utéct. V laboratorní medicíně působí mnoho výrobců laboratorních diagnostických souprav pro detekci původců infekčních onemocnění. Jednou z prvních byla společnost bio Mériux, světový leader v oblasti diagnostiky in vitro, která v polovině března 2020 oznámila uvedení tří různých testů zaměřených na epidemii covid-19 a na splnění potřeb lékařů a zdravotnických orgánů v boji proti této nově se vyskytující infekci. Postupně přišly na trh i další společnosti s novými testy pro laboratorní diagnostiku, např. Bio-Rad (obr. 3), DiaSorin, Euroimmun, Vidia, Randox Laboratories atd.

Vývoj testu ARGENE SARS-COV-2 R-GENE byl dokončen a již by měl být k dispozici. Tento test může provádět jakákoli laboratoř s využitím technologie PCR na většině dostupných platforem pro extrakci a amplifikaci nukleových kyselin. Výsledky jsou doručeny do 4–5 hodin a současně může být zpracováno velké množství vzorků pacientů. Test se opírá o odborné znalosti a vývojové know-how bio Mériux a je navržen tak, aby zajistil spolehlivou diagnózu, i když virus mutuje. V podstatě zahrnuje dva testy:
• první z nich umožňuje specifickou detekci dvou genů SARS-CoV-2;
• druhý z nich detekuje patogennější β-koronaviry včetně SARS-CoV, virů podobných SARS, SARS-CoV-2 a MERS-CoV.

Diagnostická souprava také obsahuje kontroly pro měření kvality vzorku a procesu [6]. Další dva testy se vyvíjejí paralelně a informace budou k dispozici během krátké doby. Informace o vývoji situace na poli laboratorní diagnostiky SARS-CoV-2/ covid-19, o správné interpretaci laboratorních nálezů a o úskalích detekce viru budou k dispozici v příspěvku následujícího vydání našeho časopisu.

Literatura
1. Votava M et al. Lékařská mikrobiologie speciální. 1st ed. Brno: Neptun 2003.
2. Dockrell H, Goehring RV, Zuckerman M et al. Mims‘, Medical Microbiology. 6th ed. Amsterdam: Elsiever Saunders 2018.
3. Hořejší V, Bartůňková J. Základy imunologie. Praha: Triton 2009.
4. Kingsbury DT, Wagner GE. Microbiology. 1st ed. Philadelphia: Harwal Publishing 1991.
5. SZÚ Praha. Principy přímého průkazu SARS-CoV-2 metodou RT-PCR. 2020 [online]. Dostupné z: http://www.szu.cz/uploads/Epidemiologie/Coronavirus/Lab_vysetrovani/Odborne_stanovisko_ SLM_NRL_odber_a_RT_PCR.pdf.
6. Covid-19 Update. 2020 [online]. Dostupné z: www.bioMériux.cz.
7. Covid-19 Pandemic. 2020 [online]. Dostupné z: www.ecdc.europa.eu.
8. Coronavirus Disease 2019. 2020 [online]. Dostupné z: www.cdc.gov.
9. Coronavirus SARS-CoV-2/Covid 19. 2020 [online]. Dostupné z: www.biorad.com.
10. Coronavirus disease (Covid-19) pandemic. 2020 [online]. Dostupné z: www.who.int/covid-19/information.

MUDr. Blanka Boualay
Centrum Očkování a cestovní medicíny Avenier
Ženské domovy
Ostrovského 253/3
150 00 Praha 5